Microscopia de fluorescência de três fótons!
Créditos da imagem: Escobet-Montalbán et al., 2018.
Uma técnica desenvolvida recentemente conhecida como microscopia de fluorescência light-sheet levou a muitas descobertas biológicas, permitindo que os pesquisadores criassem imagens tridimensionais de tecidos e embriões de animais vivos, por exemplo, usando tags fluorescentes. Agora, pesquisadores relatam a capacidade de aumentar a profundidade de penetração na amostra desta técnica com o uso de um fenômeno óptico conhecido como absorção de três fótons.
Neste trabalho, os pesquisadores demonstraram pela primeira vez esta técnica de microscopia de fluorescência baseada na excitação de três fótons (three-photon excitation light-sheet fluorescence microscopy). A microscopia de fluorescência de um e dois fótons surgiu como uma poderosa técnica de widefield e com baixo fotodano para obtenção rápida de imagens volumétricas de amostras biológicas bastante espessas. A extensão desta modalidade para o regime de três fótons, leva a um aumento da profundidade de penetração, permitindo a análise de amostras ainda mais espessas. Para isso, os pesquisadores fizeram uso de um laser pulsado de fentosegundo com um comprimento de onda de 1000 nm para o imageamento de esferóides celulares de 450 μm de diâmetro. Além disso, foi mostrado experimentalmente, e por meio simulações numéricas, as vantagens potenciais desta técnica para a análise microscópica de amostras cada vez mais espessas.
Para melhorar ainda mais a profundidade e campo de visão, os pesquisadores experimentaram a mudança do perfil de intensidade de luz do laser para um feixe de Bessel, que tem um núcleo central brilhante cercado por anéis concêntricos, ao invés do tradicional feixe de laser Gaussiano, como a de uma ponteira de um laser.
Em seguida, os pesquisadores planejam melhorar a técnica usando sistemas de laser em comprimentos de onda mais longos, projetados especificamente para a absorção de três fótons. Isso deve permitir a geração de imagens em maior profundidade. Em paralelo, os pesquisadores estão trabalhando para desenvolver maneiras de detectar a luz emitida pelas tags fluorescentes no interior das amostras.
Veja os detalhes deste trabalho anexado:
Three-photon light-sheet fluorescence microscopy
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